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诱导性多能干细胞

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诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells):2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体,然后引入小鼠成纤维细胞,发现可诱导其发生转化,产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。

诱导性多能干细胞( Induced pluripotent stem cells,PSCs)技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。分化的细胞在特定条件下被逆转后,恢复到全能性状态,或者形成胚胎干细胞系,或者进一步发育成新个体的过程即为细胞重编程( Cell reprogramming)。分化是基因选择性表达的结果,并没有改变遗传物质,而重编程在某种意义上就是分化的一个逆转。与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不同,PSCs技术不使用胚胎细胞或卵细胞,因此没有伦理学问题。此外,利用 IPSCS技术可以用病人自己的体细胞制备专有的干细胞,从而大大降低了免疫排斥反应发生的可能性。 iPSCS的岀现,在干细胞、表观遗传学以及生物医学等研究领域都引起了强烈的反响,使人们对多能性的调控机制有了突破性的新认识,进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离。 iPSCS在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选以及神经系统疾病、心血管疾病等临床疾病治疗等方面具有巨大的潜在价值 。

iPS细胞

诱导性多能干细胞最初是日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中,使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。随后世界各地不同科学家陆续发现其它方法同样也可以制造这种细胞。

2012年10月8日,John B. Gurdon 与 Shinya Yamanaka 因此获得诺贝尔生理学和医学奖。

2016年3月10日,由日本大阪大学眼科学教授西田幸二等人组成的科研小组在世界上首次发表了成功利用人工诱导多功能趋采干细胞(iPS细胞)一并培育出部分角膜、晶体和视网膜等眼睛主要部位细胞的研究成果。该成果被发表在本月9日的英国科学杂志《自然》电子版上。

2006年日本京都大学山中伸弥(Shinya Yamanaka)领导的实验室在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了iPS的研究。

他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子引入小鼠胚胎或皮肤纤维母细胞,发现可诱导其发生放凳虹转化,产生灶拜柜的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚柜巩犁民体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干细胞极为相似。

2007年11月,由中国科学家俞君英领衔的Thompson实验室和山中伸弥实验室几乎同时报腊影婶道,利用ips技拒影谜术同样可以诱导人皮肤纤维母细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。

所不同的是日本实验室依然采用了用逆转录病毒引入Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四种因子组合,而Thompson实验室采用了以慢病毒载体引入Oct4、Sox2加Nanog和LIN28这种因子组合。

这些研究成果被美国《科学》杂志列为2007年十大科技突破中的第二位。

2008年,哈佛大学George Daley实验室利用诱导细胞重新编程技术把采自10种不同遗传病患者病人的皮肤细胞转变为iPS,这些细胞将会在建产疾病模型、药物筛选等方面发挥重要作用。

美国科学家还发现,iPS细胞可在适当诱导条件下定向分化,如变成血细胞,再用于治疗疾病。

哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将三种在细胞发育过程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰腺外分宙捉套翻泌细胞,可以直接使其转变成与干细胞极为相似的细胞,并且可以分泌胰岛素、有效降低血糖。这表明利用诱导重新编程技术可以直接获得某一特定组织细胞,而不必先经过iPS细胞这一步。

2009年,中国科学家于2008年11月利用iPS细胞培育出小鼠—“小小”。

中国科学院动物研究所周琪研究员和上海交通大学医学院曾凡一研究员领导的研究组合作完成的工作表明,利用iPS细胞能够得到成活的具有繁殖能力的小鼠,从而在世界上第一次证明了iPS细胞与胚胎干细胞具有相似的多能性。科学家表示,这一研究成果表明iPS细胞或许同胚胎干细胞一样可以作为治疗各种疾病的潜在来源。

iPS细胞建立的简单过程

iPS细胞建立的过程主要包括:

(1)分离和培养宿主细胞;

(2)通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的基因导入宿主细胞;

(3)将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上,并于ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程;

(4)出现ES样克隆后进行iPS细胞的鉴定(细胞形态、表观遗传学、体外分化潜能等方面)。[1]


  

iPS细胞

iPS细胞的出现,在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响,这不仅是因为它在基础研究方面的重要性,更是因为它为人们带来的光明的应用前景。

在基础研究方面,它的出现,已经让人们对多能性的调控机制有了突破性的新认识。细胞重编程是一个复杂的过程,除了受细胞内因子调控外,还受到细胞外信号通路的调控。对于Oct4、Sox2和Nanog等维持干细胞自我新能力的转录因子的研究正在逐渐地展开;利用iPS细胞作为实验模型,只操纵几个因子的表达,这更会大大加速对多能性调控机理的深入研究。

在实际应用方面,iPS细胞的获得方法相对简单和稳定,不需要使用卵细胞或者胚胎。这在技术上和伦理上都比其他方法更有优势,iPS细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离,iPS细胞在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大的潜在价值。

此外,iPS细胞在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈现,iPS细胞在体外已成功地被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等。在临床疾病治疗中具有巨大应用价值。

与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不同,iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞,因此没有伦理学的问题。

利用iPS技术可以用病人自己的体细胞制备专有的干细胞,所以不会有免疫排斥的问题。

2007年11月20日,由中国科学家俞君英领衔的美国威斯康星大学詹姆斯·汤姆森研究小组在《科学》杂志发表体细胞转变成“诱导性多能干细胞”(iPS细胞)的成果,而日本京都大学教授山中申弥领导的研究小组也于同日在《细胞》杂志发表类似的研究结果。紧接着皮肤细胞转为干细胞后,美国马萨诸塞州怀德海特生物医学研究所的雅各布·汉纳的小组用来自患病小鼠尾巴的皮肤细胞产生了诱导性多能干细胞。这些研究人员然后用一个名为基因特异打靶的方法用健康版本的基因取代了涉及镰刀形红细胞贫血症的基因。当这些诱导性多能干细胞发育成造血干细胞(造血干细胞能生成各种血液和免疫细胞)后,研究人员将它们输给供体小鼠,这些细胞在小鼠身上开始产生健康的血细胞。研究人员报告说,这些小鼠的疾病症状因此有很大改善。

iPS细胞是由一些多能遗传基因导入皮肤等细胞中制造而成。在制造过程中,研究人员使用了4种遗传基因,同时加入了7种包括可阻碍特定蛋白质合成的物质和酶在内的化合物,以研究其各自的制造效率。研究结果显示,没有添加化合物时,遗传基因的导入效率为0.01%-0.05%,而加入了一种叫“巴尔普罗酸”的蛋白质合成阻碍剂之后,导入效率竟升至9.6%-14%。如果从这4种遗传基因中排除导致细胞癌化的遗传基因,只使用3种基因,过去的导入效率只有0.001%甚至更低,而加入“巴尔普罗酸”之后,其效率也提高了约50倍。研究人员认为,这很可能是因为“巴尔普罗酸”可以促进多能遗传基因的活性。今后,研究人员将就添加化合物是否会使遗传基因产生变异展开研究,以在提高制造效率的同时保证安全性。

这些研究人员警告说,用诱导性多能干细胞治疗人类疾病仍然需要克服许多关键障碍。比如,添加4个“重新编程”基因或取代疾病细胞中有缺陷基因的方法都可能有导致癌症的副作用。在诱导性多能干细胞能被考虑用于人类疗法之前,研究人员需要发展出安全的方法来解决这些以及其他可能的问题 。

2012年10月8日,瑞典卡洛琳斯卡医学院宣布,将2012年的诺贝尔医学生理学奖授予日本京都大学教授山中伸弥和英国发育生物学家剑桥大学博士约翰·戈登。

获奖成果为山中教授从皮肤细胞等体细胞中培育出了“诱导多能干细胞induced pluripotent stem cells”,即iPS干细胞。iPS干细胞能培养出各种细胞,因此山中教授的发明为再生医疗开辟了一条崭新的道路。

山中教授在2006年8月公布了他的研究成果,他将4个基因注入从老鼠尾巴中所提取的体细胞中,并成功地培养出了iPS干细胞。在2007年11月他宣布,这项实验在人体皮肤细胞上也获得了成功 。

新华社北京12月2日电(记者李斌)由于能使成体细胞“返老还童”为干细胞,诱导多功能干细胞(iPS干细胞)是干细胞领域的研究热点。中国科学院广州生物医药与健康研究院裴端卿研究员、陈捷凯副研究员等人经过多年努力,破解了iPS干细胞诱导过程中一个极为重要的障碍,论文2日在线发表在《自然・遗传学》杂志上。

2012年10月,英国和日本两位科学家因“发现成熟细胞可以被重新编程为多功能的干细胞(即诱导多功能干细胞)”而摘取2012年度诺贝尔生理学或医学奖,从而使诱导多功能干细胞更为人们所知晓。

虽然基于iPS干细胞的各种研究热火朝天,但科研人员一直受困于诱导率低、速度慢、组成复杂等障碍,研究效率并不高。这种情况又反过来制约科研人员对iPS诱导过程分子机理的理解,造就了iPS技术研究远快于基础研究,而近两年来技术研究也明显面临瓶颈的状况。

研究过程中,裴端卿及其团队发现iPS干细胞诱导过程中大量出现一类细胞克隆,外观、生长速度等各方面酷似干细胞,却没有干细胞应有的基因表达和功能。

“这些细胞克隆可以说是衣着光鲜的假货,在经典的诱导环境中大量存在,且状态稳定,犹如iPS诱导过程的路障,大部分细胞都被阻碍在路障之外,严重阻碍科研人员获得真正的iPS干细胞。”裴端卿说。

经过深入研究,科学家发现诱导培养iPS干细胞所使用的血清是诱发这个“路障”的元凶:细胞中的一种蛋白BMP蛋白对重编程过程起抑制作用。

研究人员进一步发现,这些酷似干细胞的“假货”在某些诱导条件下,如用维生素C处理,也会变成货真价实的诱导多功能干细胞。

“它们只是一种未完全重编程的iPS干细胞,换句话说,就是半成品。”裴端卿形象地解释。

哈佛大学再生医学中心教授康拉德说,这一发现是决定细胞命运的分子机制研究的重大突破,将使研究者更高效更高质量地制备诱导多功能干细胞,加快制备来自病人疾病的特异细胞系,加快阿尔茨海默氏症、帕金森氏症等疾病的药物研发。

北大“渐冻症”女博士的多能干细胞将用于攻克渐冻症。

2018年7月13日,日本京都大学联合滋贺医科大学、名古屋大学、庆应义塾大学等的研究团队宣布,成功研发出利用iPS细胞(诱导性多能干细胞)制成大量血小板的技术。该团队利用iPS细胞人工培育出血小板,随后加以提纯等操作,最终获得高质量血小板,可以用于输血。在此项研究前,人工培育出的血小板仅有四成可用于输血,临床利用率较低,且成本偏高。该项研究成果被刊登在美国科学杂志《细胞》上。研究团队带头人、京都大学教授江腾浩之表示,研究团队目前基本完成临床应用准备,将依据患者需求稳步推进人工血小板实际应用工作。今后则将研究量产血小板技术作为主要目标,以应对未来献血量不足、血小板紧缺状况,并考虑将其应用于输血治疗研究中。

一,2012年10月就iPS干细胞(诱导多能干细胞)制作心肌细胞移植给重症心脏病患者的研究成果属于虚构一事,东京大学医院的特任研究员森口尚史自己承认了造假的事实。

二,日报京都大学一个调查学术不端行为的委员会2018年1月22日公布的调查结果认定,以CiRA特聘助理教授山水康平为第一作者的研究小组,在2017年3月14日发表于美国《干细胞报告》杂志网络版上的一篇论文中,多处捏造和篡改数据,论文中6个主要数据全部造假,而6个补充数据中有5个造假。京都大学官网22日发布公告称,该大学iPS细胞研究与应用中心(CiRA)研究人员去年3月发表的一篇论文存在造假行为,CiRA负责人、诺贝尔奖得主山中伸弥为此召开记者会致歉。

由于iPS细胞自身的安全性问题,到2012为止,iPS细胞还无法应用于临床治疗,要得到安全实用的有临床应用价值的治疗型iPS细胞,必须避免使用整合性病毒以及有致癌性的外源基因。根据iPS细胞在短时间内取得的一系列突破,可以预见,iPS细胞必将解决人类面临的各种疾患。但是还面临许多急待突破瓶颈和需要深入研究的领域:

(1)研究iPS细胞自我复制、增殖和分化等的调控机制及iPS细胞体外定向诱导分化机制;

(2)充分评价iPS细胞临床应用的安全性;

(3)建立无遗传修饰的iPS细胞制备方法( 如仅利用蛋白或小分子化合物即将人的细胞重编程为iPS细胞)。

用iPS细胞复活“日本朱鹮”

首先,利用病毒媒介将可以初始化细胞的四个基因,分别导入在冷冻箱中保存的日本朱鹮的成纤维细胞中,培育出iPS细胞。再将iPS细胞移植到人工繁殖得到的日本外的朱鹮的胚胎(反复分裂的受精卵)中。这样,由日本朱鹮的iPS细胞,与日本外朱鹮的受精卵混杂在一起,就产生了一个新个体(杂交朱鹮)。使杂交朱鹮之间相互交配,就可以使日本朱鹮的iPS细胞产生生殖细胞相互交配并产生个体,也就可以使日本朱鹮复活了。

研究人员用来产生诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的方法既花时间而且效率又低。按照当前的方法,当把四种转录因子导入成体细胞如皮肤细胞中时,利用上千个皮肤细胞最终只能获得几个iPSCs。为此,在这项新的研究中,来自美国桑福德-伯纳姆医学研究所(Sanford-Burnham Medical Research Institute)的研究人员寻求激酶抑制剂的帮助,其中这些抑制剂阻断激酶---一类在细胞通信、存活和生长等方面发挥着重要作用的酶---的活性。他们发现几个激酶抑制剂当加入到起始细胞(如皮肤细胞)时,有助于产生比标准方法还要多的iPSCs。这些发现将可能加快很多领域的研究,和更好地能够让全世界的科学家们研究人类疾病和开发出新的治疗方法。相关研究结果于9月25日刊登在Nature Communications期刊上。

论文通信作者Tariq Rana博士解释道,“获得iPSCs依赖于调节细胞内的通信网络。因此,当开始操作细胞中哪些基因开启或关闭来产生多能性干细胞时,人们很可能激活了许多激酶。因为许多活性的激酶可能抑制iPSCs产生,所以对我们而言,加入激酶抑制剂来降低这种障碍可能就有意义。”

根据未参与这项研究的沙克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)癌症中心主任Tony Hunter博士的说法,鉴定出改善产生iPSCs效率的小分子为在治疗上能够使用这些细胞迈出重要的一步,而且Tariq Rana的这项新研究发现了一类蛋白激酶抑制剂能够有效地促进iPSCs形成,因此这些抑制剂在产生用于实验研究和治疗目的的iPSCs中应当是非常有用的。

在这项研究中,Rana实验室研究生Zhonghan Li着手寻找可能加快产生iPSCs过程的激酶抑制剂。利用斯坦福-伯纳姆医学研究所康拉德-普利贝斯化学基因组中心(Conrad Prebys Center for Chemical Genomics)提供的240多种抑制激酶的化合物,Li费力地将它们一个接一个地加入到他培养的细胞中然后等待观察会有什么发生。几种激酶抑制剂产生更加多的iPSCs,在某些情形下,对于培养它们的小盘子而言,能够产生太多的iPSCs。特别地,最为强效的抑制剂靶向三种激酶:AurkA、P38和IP3K。

在其他同事的帮助下,Rana和Li还证实了这些发现的特异性,甚至确定了一种抑制剂发挥有益作用背后的机制。

Rana说,“我们发现操纵这些激酶的活性能够显著性地增加细胞重编程效率。不过,更重要的是,我们也对重编程的分子机制提供了新的深入认识,并且揭示出这些激酶的新功能。我们希望这些发现将促进人们进一步筛选可能在iPSC疗法中有用的小分子。”

日本科学家利用重编程小鼠干细胞生成了皮肤和骨髓,并将它们移植到基因相同的小鼠体内,结果发现这并不会引发强烈的免疫反应。对免疫反应的恐惧可能被高估了。应该可以让那些指望利用诱导多能干细胞(iPSCs)来治疗疾病的研究人员消除疑虑。

2011年,同样发表在Nature杂志上的一项研究发现:iPSCs可能会遭受免疫系统排斥,即便是将细胞注入供体自身体内时。免疫反应有可能会破坏移植物,导致治疗无效。这使得科学界对于iPSCs实验性治疗的前景产生了质疑。

两项相互矛盾的研究之间存在的技术差异,使得人们很难估计iPSCs是否真的可以避免免疫攻击。但未参与两项研究的加州大学戴维斯分校的细胞生物学家Paul Knoepfler认为,新研究结果是“非常令人鼓舞的。它们强有力地表明,未来将人类iPSC治疗会输给同一患者,或许不会引发临床显著的免疫反应。”

研究结果是令人充满希望的,但Abe生成嵌合子小鼠的技术,以及将它们作为供体的做法,遭到了其他研究人员的质疑。徐洋说这种方法是“有缺陷的”——早在将iPSCs移植到其他小鼠体内之前,嵌合子小鼠的免疫系统就已经对来源于iPSCs的问题细胞产生了排斥或耐受。这或许可以解释为何这些移植会如此成功,而在临床上这却并非是一种可行的方法。与之相反,人类的iPSCs是在实验室培养物中分化为更特化的细胞得 。