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T4DNA连接酶

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DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上切口酶,借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外),而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。

大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感,可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性,可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物,但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。

DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子,和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近,这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的切口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用,连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链,分子量为60KD,其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。

此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外,NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率,而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶,还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。

常用的DNA连接酶有两种:来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。T4连接酶作用分三步:

(1) T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。

(2) 酶-AMP复合物结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化。

(3) 产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来.

T4DNA连接酶作用机制:分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶,因该酶在正常条件下,即能完成连接反应。T4 DNA 连接酶是一单链多肽,分子量为55.3kDa,它能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6个片断均具有粘性末端(Cohesive ends),在T4 DNA 连接酶作用下,可连接成原来的线状DNA。

T4DNA连接酶连接要求和结果

外源DNA末端性质

连接要求

连接结果

不对称粘性末端

两种限制酶消化后,需纯化载体以提高连接效率

载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;非重组克隆的背景较低;外源DNA可以定向插入到载体中。

对称性粘性末端

线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理

载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝;外源DNA会以两个方向插入到载体中。

平端

要求高浓度的DNA和连接酶

载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失;重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝;非重组克隆的背景较高 。